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基因测序二三事

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憨憨的大熊猫,做技术的人基本都这样。



 

 

一、基因测序22

1994年,我从中国科学院应用物理研究所(原名原子核研究所)硕士毕业,进入上海市儿童医院,在医学遗传研究所开始从事分子生物学研究。当时的分子生物学技术,主要是“扫针”杂交(Southern blot,杜撰的译名)、PCR和测序三大件。分子克隆还在用,已经有逐渐被PCR取代的迹象。因为分子克隆是体内基因放大,PCR是体外基因放大,二者的作用一样,但是PCR更简便。这期间,差异显示PCR (differential display PCR, ddPCR,名称缩写与现在时髦的数字PCR一样,dropletdigital PCR)技术突然热闹一时,但是不能解决任何问题,不久就销声匿迹。

从那时到现在,22年来,我相继在5家公司工作:上海市儿童医院,美国ABI,美国Illumina,药明康德,以及最近和朋友们一起创立的阅尔基因。公司在变,工作内容却变化不大,主要就是基因测序。从最初的聚丙烯酰胺凝胶电泳-放射自显影手工测序,到一代测序,到二代测序,基因测序经历的所有重要技术变革,我都经历过,并且部分参与其中。这是我的主要职业经历,是基因测序技术完整的发展历程,也是中国分子诊断和基因检验行业从萌芽走向繁荣的完整过程。

1988年本科毕业于武汉华中师范大学生物系,本职工作是当教师。大学毕业后,我在武穴中学当了3年教师,带领学生们冲刺中国最公平的选拔——高考。虽然后来考上研究生,进入工业界,不再当老师了,可是现在回头来看,我的新工作仍然是教师,只不过是另一种形式。这些年来,我作为全球基因检测行业龙头企业的应用科学家和主管,为中国培训了大量的基因检测技术人才。

 

二、与华大基因的一点渊源

和我一路走来的是华大基因。尽管很多人不喜欢这家公司,但是毫无疑问,它是中国基因检验的领头羊,世界最大的基因工厂;一批又一批人才从华大出来,去开辟他们自己的天地,华大又被称为中国基因检验的黄埔军校。当华大刚从北京搬家到深圳,还只有几台GA的时候,我代表Illumina去作培训、支持工作,为华大年轻的员工们授课讲解二代测序的原理和应用,解答他们日常工作中遇到的技术问题,在测序出现故障的时候,帮助他们分析原因,排除障碍,甚至作出这次测序是否还要继续进行下去的决定,并且尽一切可能为他们向Illumina的美国总部申请试剂赔偿。当华大在北京空港开发区刚刚起步,还只有几台377的时候,我代表ABI去作支持、培训、安装工作。记得3700测序仪刚上市的时候,我在华大工作一个月,用华大的样本做实验,向他们展示3700的性能。每天半夜,我一个人沿着田间小路,走过大片漆黑的荒凉田野,横穿永远有大货车连绵不断呼啸而过的京顺路,走路去宾馆,冻得瑟瑟发抖。

 

三、在ABI举办培训班

基因测序没有现在这么火热的时候,我的大部分工作时间就投入到了定量PCR中去。精心编写讲义,从原理、应用、耗材、案例,到故障排除,覆盖所有相关方面,尽可能地做到对客户有所帮助。无数热心人匿名把我的讲义上传到各种网站。至今百度“定量PCR”,还能搜索到各种版本的全套的我的讲义。

ABI工作8年,整整7年中国区只有我一个应用专家,负责基因测序、片段分析、定量PCR、法医亲子鉴定,实际上就是ABI公司的所有DNA产品线。也许是用得太顺手了吧,尽管客户数量一直在飞快地增长,客户所在的地区从一线城市扩大到县城,各种配套支持部门逐步建立,员工人数越来越多,但是ABI公司就是一直稳笃笃地不增加应用专家人手。靠电话和邮件我已经忙不赢了,现场拜访、与客户面对面交流更是奢侈,需要销售经理特殊申请、维修经理特批才行,于是我就建立了培训班制度,以提高培训的效率。我根据客户的分布和数量,给自己制定的规则是一个月开2班,每班3天,在北京、上海和广州轮流举办。所有授课都是我一个人从头讲到尾,连续3天;所有的会务工作,从租宾馆会场、报名、登记,到午餐、茶歇,都是我一个人操办。开始举办培训班的时候,身体好,讲多久都没问题,本来就是当老师料;后来时间长了,每次3天讲完,回到办公室静下来的时候就感觉头晕,坐在凳子上不想动,要过一会儿才能慢慢地恢复。

 

四、为Illumina改进二代测序技术

2007-2011年,我在二代测序行业的绝对巨头、美国Illumina公司担任北亚区应用主管,工作了4年。Illumina最早型号的高通量测序仪叫GA (Genome Analyzer),现在已经是博物馆里的老古董了。我在香港中文大学对一台GA进行安装后的标准品验证时,运气不好,图片里散布着很多异常的亮点。亮点是GA以及所有Illumina测序平台的共同问题,只要数量不多,并不严重。因为二代测序产生的数据量巨大,损失一点并不影响整体数据质量和研究结论。可是这次的亮点不同寻常,数量过多,引起了客户的注意。我们开始一张一张地看图,仔细比较不同lane、不同cycle,比较同一lane里的不同位置,并且看出了规律:从每条lane的进口端到出口端,亮点密度逐渐减少;亮点的位置是变化的,不固定。我们研究了几天,在一次从实验室回宾馆的出租车上,我突然想出一种假设,可以解释所有观察到的现象:试剂里存在有未充分溶解的微小结晶颗粒,它们在测序过程中进入flow cell的各个lane里,由于反射激发光而产生亮点。进口端试剂浓度高,亮点多;出口端试剂经过消耗浓度降低,亮点少。每换一个cycle,试剂重新灌注一次,这种情况就重复出现。

从这个假设出发,解决问题的方法也有了,简单易行:在配试剂的时候,用0.2微米孔径的滤膜过滤含有荧光标记的dNTP混合液,去除试剂中残留的结晶颗粒。客户按我的建议进行了试验。第二天,我们惊喜地发现,亮点大幅度减少,效果非常明显。

 

五、在药明康德创建基因组中心的轶事

2011年进入药明康德之后,我与早期入职的几位核心同事一道,创建了基因组学中心,招兵买马建立了实验室团队,并负责基因中心全部Illumina测序平台的日常运营,也有一些故事值得分享。当初,二代测序全外显子测序技术刚刚建立,Roche NimblGen, Agilent SureSelect, Illumina TruSeq三足鼎立,市场上异口同声讲TruSeq外显子试剂盒是垃圾,没法用。早期试用客户得到的数据质量的确很差,似乎印证了这个观点。我在药明康德开展外显子项目,仔细比较,发现数据差的是肿瘤项目,而且DNA呈现图中所呈现的图式,于是判断细胞凋亡是数据质量低的原因,一举解决了这个问题。此后进行外显子测序,我根据DNA质检结果,可以准确预测NGS数据质量,为客户和药明康德节省了大量损失,也为药明康德在基因测序行业创造了“数据质量高”的良好声誉。







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